Гистохимия: методы Гистохимические методы: введение Буферные растворы и их приготовление Выявление нуклеиновых кислот Выявление (суммарное) белков Гистохимические методы для полисахаридов и протеидов Окрашивание жиров и липидов Металлы, анионы, экзогенные пигменты Гистохимия ферментов Гистохимия нервной системы
Буферные растворы и их приготовление
Химические процессы, протекающие в тканях организма, особенно с участием ферментов, требуют наличия ряда условий, среди которых важное значение имеет рН среды. Как известно, степень кислотности данного раствора зависит от концентрации ионов Н+ , а степень его щелочности — от концентрации ионов ОН-.
При определенной температуре произведение положительно и отрицательно заряженных ионов -величина постоянная. Зная один из показателей, можно определить другой. Исходя из этого положения, в химии принято обозначать кислотность или щелочность раствора условно через водородный показатель (рН), представляющий логарифм концентрации ионов Н+ , взятый с обратным знаком. Так, при рН 7,0 концентрация ионов Н+ равна концентрации ионов ОН- и раствор имеет нейтральную реакцию. Чем показатель рН меньше 7,0, тем концентрация ионов Н+ выше (ведь показатель с обратным знаком) и тем больше кислотность раствора. Наоборот, чем рН больше 7,0, тем меньше ионов Н+ в растворе и более выражены его щелочные свойства.
Различные ферменты требуют для проявления своей активности разные значения рН.
Так, оптимальное условие для действия щелочной фосфатазы при рН 9,0, тогда как для кислой фосфатазы требуется рН 5,0.
Чтобы обеспечить наилучшие условия для проявления активности гистохимически выявляемого фермента, необходимо, чтобы в среде инкубации поддерживалось значение рН, оптимальное для данного фермента. Это условие достигается введением в среду инкубации буферных смесей с заданными значениями рН. Наиболее распространенными буферными растворами являются фосфатный, ацетатный и трис-буфер.
Приготовление буферных растворов
Прежде чем дать прописи буферных смесей, необходимо напомнить, что для определения концентрации растворов реактивов приняты понятия молярность (М) и нормальность (N).
Молярность раствора (М) — количество грамм-молей вещества, содержащихся в 1 л раствора. Грамм-моль — молекулярная масса данного вещества, выраженная в граммах. Например, для приготовления раствора в концентрации 0,2 М необходимо на 1 л раствора взять вещество в количестве, равном 0,2 его молекулярной массы.
Нормальность (N) — количество грамм-эквивалентов в 1 л раствора.
Грамм-экивалент — количество данного вещества, химически равноценное в данной реакции 1 грамм-атому водорода.
Для сложных веществ — это количество вещества, соответствующее прямо или косвенно при химических превращениях 1 грамму водорода или 8 граммам кислорода.
Эоснования = Моснования / число замещаемых в реакции гидроксильных групп
Экислоты = Мкислоты / число замещаемых в реакции атомов водорода
Эсоли = Мсоли / произведение числа катионов на его заряд
Э H2SO4 = М H2SO4 / 2 = 98 / 2 = 49 г
Э Ca(OH)2 = М Ca(OH)2 / 2 = 74 / 2 = 37 г
Э Al2(SO4)3 = М Al2(SO4)3 / (2· 3) = 342 / 2= 57 г
Фосфатный буфер (рН 6,0—8,0).
А — 0,2 М КН2 РО4 (13,6 г соли в 1 л дистиллированной воды);
Б — 0,2 М Na2 НР04 (31,2 г Na2 НРО4 . 2Н2 О в 1л дистиллированной воды).
Для получения 100 мл буфера нужного рН следует слить растворы Аи Б в количествах, указанных в табл. 1.
Источник
IV. Способы приготовления буферных растворов с заданным значением рН.
Существует два способа приготовления буферных растворов:
1) смешение растворов сопряжённых кислоты и основания.
2) частичная нейтрализация слабой кислоты — щёлочью или слабого основания – сильной кислотой.
Второй способ широко используется в лабораторной практике при приготовлении буферных смесей с использованием рН – метров, когда нейтрализацию ведут до нужного значения рН, величину которого контролируют по прибору.
1) Приготовить фосфатный буфер объемом Vбуф. с данным значением рН методом смешения растворов дигидрофосфата и гидрофосфата натрия:
Определим объемы Vк и V0 исходных растворов сопряжённых кислоты и основания, если известны их концентрации Ск (нач) и С0 (нач) . Для расчёта необходимо составить два уравнения, первое из которых очевидно
а второе получим на основе уравнения (4).
Поскольку количества солей в буферном растворе равно их количеству в соответствующих объёмах исходных растворов, то n0 / в буферном растворе = С0 (нач) × V0
Подставляя эти величины в уравнение (4), находим второе уравнение связи между искомыми объёмами:
Решая систему из двух уравнений (6 — 7) или (6 – 8), находим объёмы растворов Vк и V0, при смешении которых образуется буферный раствор с заданным значением рН.
2) Этот же буферный раствор можно приготовить путём частичной нейтрализации фосфорной кислоты щёлочью, например NaOH.
Пусть в растворе фосфорной кислоты объёмом V литров и молярной концентрацией
С (Н3РО4) моль/л содержится n (Н3РО4) = С×V = а моль Н3РО4. Фосфатный буфер содержит смесь двух солей NaH2PO4 / Na2HPO4, поэтому расчет нейтрализации кислоты проводят в два этапа: перевод а моль фосфорной кислоты в дигидрофосфат – ион (I этап) и далее частичный перевод дигидрофосфат-иона в гидрофосфат-ион до нужного значения рН (II этап):
Необходимое количество щёлочи х для осуществления второго этапа определяют по уравнению (4):
Общее количество NaOH равно nобщ.(I+II этапы) = а + х, и если в исходныйраствор фосфорной кислоты добавляют кристаллический NaOH, то его масса равна m (NaOH) = (a+x) × M (NaOH), а если добавляют раствор щёлочи, то его объём равен Vщёлочи = (а-х) / С (NaOH).
V. Расчёт изменения рН при добавлении к фосфатному буферному раствору небольших добавок сильной кислоты или щёлочи, а также при его разбавлении.
Пусть исходный буферный раствор объёмом V содержит nк моль кислоты и n0 моль сопряжённого основания, тогда в соответствии с уравнением (4): рН(нач.) = рК2 + lg (n0/nк).
а) добавка сильной кислоты НnX: n (Н + ) = С (1/nНnX) × Vдоб. = х моль и согласно (1) конечные количества компонентов буферной смеси равны: n0 (кон.) = n0 – х
Величина рН конечного состояния рассчитывается по формуле:
причём происходит небольшой сдвиг в кислую область рН (нач.) > рН (кон.) .
б) добавка щёлочи M(OH)n: n(ОН — ) = С(1/n M(OH)n) × Vдоб. = х моль и согласно (2) конечные количества компонентов буферной смеси равны: n0 (кон.) = n0 + х
Величина рН конечного состояния рассчитывается по формуле:
причём происходит небольшой сдвиг в щелочную область рН (нач.) (кон.) .
Замечание: n0 и nк относятся к объёму буферного раствора, в который сделаны добавки.
в) При разбавлении буферного раствора водой исходные концентрации его компонентов С0 и Ск уменьшаются в одинаковое число раз, поэтому их отношение в уравнении (3) остаётся неизменным и, следовательно, величина рН сохраняется.
Источник
Форум химиков
самодельный калибровочный раствор
самодельный калибровочный раствор
Сообщение alberoth » Чт дек 11, 2008 3:09 pm
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение amik » Чт дек 11, 2008 4:53 pm
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение nitro » Пт дек 12, 2008 11:14 am
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение amik » Пт дек 12, 2008 12:07 pm
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение Polychemist » Пт дек 12, 2008 12:46 pm
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение nitro » Пт дек 12, 2008 12:54 pm
pH ацетатного и аммиачного буферного раствора незначительно (менее 0,01 ед. пэаш) изменяется при 10-кратном разбавлении. Попариться с приготовлением и калибровать pH-метры ими можно.
Polychemist, понятное дело, что с набором буферов для pH-метрии — задача решена, но если их нет. Не беда.
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение ALTAIR » Пт дек 12, 2008 1:07 pm
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение amik » Пт дек 12, 2008 1:42 pm
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение avor » Пт дек 12, 2008 6:19 pm
Можно! Я делаю сам раствор IV и V
Для V использую буру хч, для IV соли чда(отечественные хч найти сложно, а осч почти уникальны, если только с дореформенных времен), только одну из них надо прокалить(не помню какую, по моему натриевую) чтоб узнать процент кристалогидратной воды
раствор III пока есть в старых запасах.
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение Акира » Вс янв 18, 2009 11:51 pm
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение chimist » Пн янв 19, 2009 1:04 am
1. Если раствор насыщенный, то избыток вещества не будет растворятся при данной температуре, т.е. это нормально. С другой стороны, если фиксанал гидроксида кальция старый или раствор постоит открытым, то рН такого раствора будет отличатся от заявленного. Лучше калибровать электрод по раствору с меньшим значением рН, если только не предполагается работать в сильно щелочных растворах.
2. Ползучесть хлорида калия по электроду можно предотвратить, если гидрофобизировать часть стеклянного корпуса электрода («колечком») , которую не погружают в раствор. Однако лучше не заморачиваться.
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение Акира » Вт янв 20, 2009 2:11 am
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение darkweder » Пт апр 20, 2018 11:32 am
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение antabu » Сб апр 21, 2018 5:09 am
Re: самодельный калибровочный раствор
Сообщение avor » Сб апр 21, 2018 7:34 am
Источник
IV. Способы приготовления буферных растворов с заданным значением рН.
Существует два способа приготовления буферных растворов:
1) смешение растворов сопряжённых кислоты и основания.
2) частичная нейтрализация слабой кислоты — щёлочью или слабого основания – сильной кислотой.
Второй способ широко используется в лабораторной практике при приготовлении буферных смесей с использованием рН – метров, когда нейтрализацию ведут до нужного значения рН, величину которого контролируют по прибору.
1) Приготовить фосфатный буфер объемом Vбуф. с данным значением рН методом смешения растворов дигидрофосфата и гидрофосфата натрия:
Определим объемы Vк и V0 исходных растворов сопряжённых кислоты и основания, если известны их концентрации Ск (нач) и С0 (нач) . Для расчёта необходимо составить два уравнения, первое из которых очевидно
а второе получим на основе уравнения (4).
Поскольку количества солей в буферном растворе равно их количеству в соответствующих объёмах исходных растворов, то n0 / в буферном растворе = С0 (нач) × V0
Подставляя эти величины в уравнение (4), находим второе уравнение связи между искомыми объёмами:
Решая систему из двух уравнений (6 — 7) или (6 – 8), находим объёмы растворов Vк и V0, при смешении которых образуется буферный раствор с заданным значением рН.
2) Этот же буферный раствор можно приготовить путём частичной нейтрализации фосфорной кислоты щёлочью, например NaOH.
Пусть в растворе фосфорной кислоты объёмом V литров и молярной концентрацией
С (Н3РО4) моль/л содержится n (Н3РО4) = С×V = а моль Н3РО4. Фосфатный буфер содержит смесь двух солей NaH2PO4 / Na2HPO4, поэтому расчет нейтрализации кислоты проводят в два этапа: перевод а моль фосфорной кислоты в дигидрофосфат – ион (I этап) и далее частичный перевод дигидрофосфат-иона в гидрофосфат-ион до нужного значения рН (II этап):
Необходимое количество щёлочи х для осуществления второго этапа определяют по уравнению (4):
Общее количество NaOH равно nобщ.(I+II этапы) = а + х, и если в исходныйраствор фосфорной кислоты добавляют кристаллический NaOH, то его масса равна m (NaOH) = (a+x) × M (NaOH), а если добавляют раствор щёлочи, то его объём равен Vщёлочи = (а-х) / С (NaOH).
V. Расчёт изменения рН при добавлении к фосфатному буферному раствору небольших добавок сильной кислоты или щёлочи, а также при его разбавлении.
Пусть исходный буферный раствор объёмом V содержит nк моль кислоты и n0 моль сопряжённого основания, тогда в соответствии с уравнением (4): рН(нач.) = рК2 + lg (n0/nк).
а) добавка сильной кислоты НnX: n (Н + ) = С (1/nНnX) × Vдоб. = х моль и согласно (1) конечные количества компонентов буферной смеси равны: n0 (кон.) = n0 – х
Величина рН конечного состояния рассчитывается по формуле:
причём происходит небольшой сдвиг в кислую область рН (нач.) > рН (кон.) .
б) добавка щёлочи M(OH)n: n(ОН — ) = С(1/n M(OH)n) × Vдоб. = х моль и согласно (2) конечные количества компонентов буферной смеси равны: n0 (кон.) = n0 + х
Величина рН конечного состояния рассчитывается по формуле:
причём происходит небольшой сдвиг в щелочную область рН (нач.) (кон.) .
Замечание: n0 и nк относятся к объёму буферного раствора, в который сделаны добавки.
в) При разбавлении буферного раствора водой исходные концентрации его компонентов С0 и Ск уменьшаются в одинаковое число раз, поэтому их отношение в уравнении (3) остаётся неизменным и, следовательно, величина рН сохраняется.
