Как сделать своими руками бактериофаг

Как работают бактериофаги

Как работают бактериофаги

о ткрытие пенициллина – первого антибиотика природного происхождения, воспринималось поначалу как шанс раз и навсегда победить инфекционные заболевания, уносившие миллионы жизней. Однако во второй половине прошлого века первоначальная эйфория пошла на убыль: выяснилось, что бактерии благодаря мутациям могут приобретать устойчивость к любому антибиотику и даже обмениваться между собой этими генами. Так началась «гонка вооружений» человека и бактерий.

Между препаратами бактериофагов и химическими антибиотиками существует принципиальное различие: антибиотик, в отличие от фагового препарата, убивает всё на своем пути, включая содружество полезных микроскопических обитателей организма.

Cовместная эволюция бактерий и фагов за последние 3 миллиарда лет привела к тому, что практически для любой болезнетворной бактерии имеется соответствующий вирус-«убийца».

В отличие от обычных антибиотиков, бактериофаги модифицируют свои генетические программы сами, что снимает проблему устойчивости. Результат – высокая избирательность: конкретный бактериофаг обычно эффективен в отношении лишь одного определенного бактериального вида или даже штамма бактерий.

Действие бактериофагов

Очень важным является то, что бактериофаги не трогают не «свои» бактерии, поэтому не вызывают гибель «хорошей» микрофлоры и, конечно, абсолютно безопасны для клеток высших организмов, включая человека.

При фаготерапии отсутствуют побочные эффекты, такие как аллергия, дисбактериоз, вторичные инфекции (например, грибковые), что нередко наблюдается при приеме антибиотиков. Бактериофаги могут применяться в комбинированной терапии с любыми лекарственными препаратами, включая антибиотики.

Препараты бактериофагов представляют собой раствор, используют их либо местно (например, на кожу или слизистые), либо принимают внутрь. В организме бактериофаги концентрируются в местах наибольшего поражения и размножаются до тех пор, пока находят бактерии-«мишени». После того, как бактерии-«мишени» закончились, фаги выводятся из организма.

Главная цель фаготерапии – остановить и повернуть вспять инфекционный процесс, чтобы дать иммунной системе организма возможность справиться с болезнью.

С помощью бактериофагов лечат

Инфекции мочеполовой системы

Инфекции органов дыхания

Инфекции желудочно-кишечного тракта

Ожоговые и раневые инфекции

Трофические язвы

Остеомиелит

Гнойно-воспалительные заболевания кожи и слизистых
Внутрибольничные инфекции

В идеальном случае перед началом лечения у конкретного больного следует выделить болезнетворную бактерию в культуру и подобрать бактериофаг из «коллекции» уже известных бактериальных вирусов.

Препараты бактериофагов трудно поддаются стандартизации из-за специфики производства. Даже опытный специалист не всегда может заранее предсказать эффективность того или иного препарата у конкретного пациента, так как разные бактериальные штаммы бактерий могут вызывать схожие проявления болезни. Выход – производство «коктейлей» из фагов, способных убивать разные штаммы и даже виды возбудителей. И такие препараты уже существуют — это комплексные, или поливалентные препараты бактериофагов

Источник

Лечение бактериофагами: за и против

На протяжении многих десятков лет антибиотики спасают человечество, однако существует мнение, что их эра подходит к концу. Причиной тому стало легкомыслие людей. Многие пациенты — как правило, это успешные карьеристы, профессионалы, у которых нет времени на посещение врача — практикуют самостоятельный прием препаратов. В результате все большее количество инфекций приобретает устойчивость к воздействию антибиотиков, снижается действенность и эффективность этих препаратов. Рекомендации Всемирной организации здравоохранения — строго контролировать прием антибиотиков, во всех случаях, где это возможно, искать им альтернативу. В настоящее время эффективным альтернативным заменителем антибиотиков считаются бактериофаги.

Бактериофаг — это вирус, который размножается в живых клетках хозяина. Он состоит из ДНК и белковой оболочки. Важное преимущество бактериофагов перед антибиотиками в том, что они не нарушают нормальную микрофлору организма. Это возможно за счет целевого воздействия: бактериофаги присоединяются лишь к одному типу микробов.

ДНК фага размножается, проникая внутрь болезнетворной клетки, далее разрывает оболочку клетки-хозяина и поражает микробы. Бактериофаги часто используют в комплексной антибактериальной терапии. Если нет смертельной угрозы для пациента, этому альтернативному средству борьбы с болезнями отдается предпочтение. В настоящее время создано многообразие фагов, выпущено большое количество лекарственных форм — свечи, аэрозоли, растворы, таблетки и пр.

Бактериофаги используют во многих сферах медицины:

• гинекологии;
• хирургии;
• отоларингологии;
• гастроэнтерологии;
• пульмонологии;
• урологии.

В зависимости от возбудителя болезней и вида заболевания назначается определенный медикамент.

Преимущества бактериофагов перед антибиотиками:

• не вызывают привыкания и не угнетают иммунитет человека;
• совместимы со всеми лекарственными препаратами, в том числе с антибиотиками (бактериофаги усиливают их действие);
• не вызывают резистентности у бактериальных культур;
• эффективны в лечении малочувствительных к антибиотикам вялотекущих бактериальных инфекций;
• избирательно воздействуют, не уничтожают полезную бактериальную микрофлору;
• не имеют противопоказаний.

В то же время использовать бактериофаги самостоятельно, без назначения и наблюдения специалиста может быть не менее опасно, чем антибиотики. Ведь для того, чтобы выявить возбудителя болезни и понять, насколько он чувствителен к фагам, требуется специальное исследование.

Однако бактериофаги используют не только в лечении, но и в профилактике заболеваний бактериальной природы, например, вызванных:

• гемолитической кишечной палочкой;
• стафилококком, стрептококком, энтерококком;
• синегнойной палочкой;
• протеем и т.д.;

На протяжении длительного времени бактериофаги успешно используются при лечении:

• гнойно-воспалительных заболеваний полости рта и околозубных тканей;
• заболеваний ЛОР-органов;
• дисбактериоза у взрослых и детей;
• при пиодермии кожных покровов, укусах насекомых и животных, раневых инфекциях;
• бактериальных заболеваний мочеполовой системы.

Также их используют для профилактики в случае осложнений бактериального характера при ОРЗ, гриппе. При раннем выявлении возбудителя, при грамотно назначенной профилактике эффективность фаговых препаратов наибольшая.

Несмотря на все плюсы, вряд ли можно предположить, что бактериофаги способны полностью исключить использование антибиотиков на данном этапе развития науки и медицины. Оба этих препарата применяются в разных ситуациях и, скорее, дополняют друг друга. Как и в случае с антибиотиками, важно следить за тем, чтобы их использование не вышло из-под контроля специалистов. Только так они останутся важным подспорьем в борьбе с инфекциями.

Алешкин А. В. Бактериофаги в инфекционной патологии: прошлое, настоящее и будущее // Лекции по исследованию и применению бактериофагов. 2016. Ульяновск. С. 11—51.

Бактериофаги: биология и применение. 2012. М: «Научный мир». Ред.: Э. Каттер и А. Сулаквелидзе.Górski A. et al. Phages targeting infected tissues: novel approach to phage therapy. // Future Microbiol. 2015. V. 10. P. 199—204.

Międzybrodzki R. et al. Clinical aspects of phage therapy // Adv. Virus. Res. 2012. V. 83. P. 73—121.

Отоларинголог, врач высшей категории, к.м.н. директор «СМЦ» Катеринчева Ольга Александровна

Источник

Бактериофаги

БАКТЕРИОФАГИ КАК АЛЬТЕРНАТИВА АНТИБИОТИКАМ В ЛЕЧЕНИИ ИНФЕКЦИЙ

Бактериофаги — вирусы бактерий, естественные микроорганизмы, которые, размножаясь внутри бактериальной клетки, ведут к ее быстрой гибели.

Из истории открытия

В 1896 году английский бактериолог Э. Ханкин, исследуя антибактериальное действие воды индийских рек, пришел к выводу о существовании агента, проходящего через бактериальные фильтры и вызывающего лизис холерных вибрионов. Российский микробиолог Н. Ф. Гамалея в 1897 году наблюдал лизис бацилл сибирской язвы. Однако первой научной публикацией о фагах стала статья английского микробиолога Ф. Туорта, в которой он в 1915 году описал инфекционное поражение стафилококков, значительно изменявшее морфологию колоний. В 1917 году канадский бактериолог Ф. Д’Эрелль независимо от Туорта сообщил об открытии вируса, «пожирающего» бактерии — бактериофага.

Интересный факт: при нанесении бактериофага на влажные слизистые он за 20 минут очищает их от определенного вида бактерий, например от стафилококка. Так быстро не работает ни один антибиотик.

Действие бактериофагов отличается от действия антибиотиков:

1. Для определенного вида бактерий существует свой определенный бактериофаг. Но стоит отметить, что не ко всем бактериям есть бактериофаги (это основной недостаток этих препаратов). Для решения вопроса, какую терапию выбрать для лечения инфекции, врач должен сначала взять материал для посева на флору с точным определением вида возбудителя и только после получения анализа на чувствительность микроорганизма к бактериофагам выбрать препарат.
2. Бактериофаги не действуют на нормофлору (нормальные бактерии), поэтому лечение бактериофагами экологично и не требует коррекции нормофлоры.
3. Бактериофаги не влияют на организм человека, поскольку не способны проникнуть в клетки человека. Поэтому бактериофаги не токсичны и не вызывают побочных эффектов.
4. После уничтожения патогена элиминируются (самовыводятся) из организма.
5. Бактериофаги просты в применении: большинство их производится в жидком виде. Доступно наружное орошение при местном применении, полоскании, в виде микроклизм при кишечных инфекциях. Но действуют бактериофаги только местно, то есть именно там, где вы их применяете при полоскании, орошении и закапывании. В отличие от антибиотиков, которые при приеме внутрь распределяются по организму и действуют во всех органах и тканях.
6. Бактериофаги стимулируют местный иммунитет, так как частицы уничтоженных бактерий побуждают иммунную систему к выработке специфических антител. Из-за этого свойства бактериофаги являются препаратом выбора в лечении бактерионосительства (например, стафилококконосительства) и хронических форм бактериальных инфекций.
7. Сочетаются с другими препаратами, в том числе с антибиотиками. Их совместное применение ведет к быстрому выздоровлению от бактериальной инфекции.
8. По совокупности описанных свойств бактериофаги применимы как основной препарат для лечения бактериальных инфекций у беременных, детей с рождения и людей пожилого возраста, а также в тех случаях, когда имеется полирезистентность микроорганизма к антибиотикам.

В лаборатории KDL предлагается 2 варианта посевов на флору с определением чувствительности выделенной культуры микроорганизма к препаратам бактериофагов и разным наборам антибиотиков в зависимости от ситуации пациента (выбирает врач), например:

Какие инфекции можно лечить бактериофагами:

• кожные, ожоговые и раневые инфекции;
• инфекции ЛОР органов;
• инфекции урогенитального тракта;
• отдельные инфекции желудочно-кишечного тракта.

Возбудителями этих инфекций могут быть такие бактерии, как золотистый стафилококк, синегнойная палочка, патогенные формы кишечной палочки, сальмонеллы, стрептококки.

В Новосибирском научном центре технологии персонализированного лечения бактериофагами в большой коллекции бактериофагов есть уникальные штаммы, способные бороться с недавно появившимися и уже получившими широкое распространение возбудителями больничных инфекций, такими как грамотрицательные бактерии Acinetobacter baumanii, Stenotrophomonas maltophilia и др.

Последние годы ознаменовались широкими исследованиями бактериофагов из-за нарастающей проблемы антибиотикорезистентности микроорганизмов, которые находят всё новые применения не только в терапии и профилактике, но и в биотехнологиях. Их очевидным практическим результатом должно стать возникновение нового мощного направления персонализированной медицины, а также создание целого спектра технологий в пищевой промышленности, ветеринарии, сельском хозяйстве и в производстве современных материалов. Мы ждем, что второе столетие исследований бактериофагов принесет не меньше открытий, чем первое.

Источник

Способ получения пиобактериофага

Использование: биотехнология, производство медицинских биологических препаратов. Сущность способа: проводят культивирование бактерий и бактериофагов стафилококка, стрептококка, синегнойной палочки, кишечной палочки, протея и клебсиелл в жидкой питательной среде. Каждый вид бактерий и бактериофагов культивируют раздельно, но условия культивирования являются общими для всех видов. Культивирование проводится в условиях интенсивной аэрации и перемешивания при 30 — 70%-ном насыщении растворенным кислородом культуральной среды с использованием экспоненциально размножающейся бактериальной популяции. Полученные фаголизаты всех бактериофагов сводят в единый объем, перемешивают и подвергают микро- и ультрафильтрации в режиме тангенциального потока через мембраны с размером пор 0,2 мкм и мембраны с порогом задержания веществ 150 — 200 КД, после чего проводят заключительную стерилизующую микрофильтрацию. Степень очистки бактериофагов от метаболитов бактерий и белков среды составляет 98 1,1% . Способ позволяет расшырить спектр антибактериальной активности препарата и обеспечивает высокий выход биомассы бактериофагов. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству медицинских биологических препаратов.

Гнойно-воспалительные заболевания, вызванные бактериями стафилококка, стрептококка, синегнойной и кишечной палочкой, протеем, широко распространены и трудно поддаются антибиотикотерапии, часто заканчиваются смертельным исходом, особенно у детей раннего возраста. В последние годы наряду с перечисленными возбудителями в 10-30% случаев от больных выделяются бактерии клебсиелл пневмонии.

Известен препарат пиобактериофага комбинированного, включающий бактериофаги стафилококка, стрептококка, синегнойной палочки, кишечной палочки и протея. Способ получения пиобактериофага предусматривает раздельное статическое культивирование бактериофагов в жидкой питательной среде в бутылях с использованием одномоментного добавления в питательную среду бактериальных клеток до концентрации 310 7 в 1 мл, находящихся в стадии отмирания (18-часовая культура) и маточного фага в количестве 0,2% от объема среды, без учета множественности заражения и урожайности бактериофагов с последующей стерилизующей микрофильтрацией в тупиковом режиме через керамические фильтры (свечи Шамберлана).

Недостатками известного способа являются: низкий выход биомассы бактериофагов при их культивировании, обусловленный фазой развития (фаза отмирания) бактериальной популяции, использующейся для размножения фагов, а также неоптимизированными условиями культивирования; нетехнологичность, связанная с использованием для стерилизующей микрофильтрации тупикового режима, керамических фильтров, обладающих низкой производительностью в связи с фильтрацией в тупиковом режиме; нетехнологичность способа, обусловленная получением фагов в бутылях и невозможность получения препарата в больших объемах; реактогенность препарата, связанная с присутствием в составе препарата белков питательной среды и метаболитов бактериальных клеток, образующихся в процессе роста бактериальной популяции, а также при фаголизисе; недостаточно широкий спектр действия препарата, связанный с отсутствием в составе препарата бактериофагов клебсиелл пневмонии; длительность технологического цикла более 30 ч.

Целью изобретения является разработка нового способа получения пиобактериофага и расширение спектра действия препарата.

Для этого в состав препарата, содержащего бактериофаги стафиликокка, стрептококка, синегнойной палочки, кишечной палочки и протея, дополнительно вводят бактериофаги клебсиелл, получение бактериофагов проводят с использованием экспоненциально размножающейся бактериальной популяции в жидкой питательной среде с последующей очисткой препарата путем микро- и ультрафильтрации в режиме тангенциального потока. Микрофильтрацию проводят на мембранах с размером пор 0,2 мкм, а ультрафильтрацию на мембранах с порогом задержания веществ 150-200 КД. После очистки проводят стерилизующую микрофильтрацию.

Сравнение существенных признаков предлагаемого технического решения и прототипа показывает, что общим для них является процесс культивирования в жидкой питательной среде для получения биомассы фагов стафилококка, стрептококка, синегнойной, кишечной палочки и протея, а также процесс заключительной стерилизующей микрофильтрации фаголизатов для удаления бактериальных клеток.

Отличительными существенными признаками предлагаемого способа являются: введение в состав препарата бактериофагов клебсиелл пневмонии, позволяющее на 752% расширить спектр литической активности препарата в отношении бактерий клебсиелл пневмонии и расширить показания к его применению (в прототипе компонент бактериофагов клебсиелл пневмонии отсутствует); использование вместо статического культивирования на бактериальных клетках в стадии отмирания без учета урожайности фагов и множественности заражения (прототип) периодического динамического управляемого культивирования на экспоненциально размножающейся бактериальной популяции, позволяющего повысить на 50-90% выход биомассы фагов; очистка препарата микрофильтрацией через мембраны с размером пор 0,2 мкм и ультрафильтрацией в режиме тангенциального потока на плоских мембранах УПМП с порогом задержания веществ 150-200 КД для очистки препарата фагов от метаболитов бактерий и белков питательной среды и снижения реактогенности и токсичности препарата при полостном введении. Степень очистки в сравнении с прототипом 981,1%
В литературе описан способ получения бактериофагов энтеробактерий (авт. св. N 1058283), предусматривающий периодическое динамическое культивирование на экспоненциально размножающейся бактериальной популяции.

Однако использование экспоненциально размножающейся бактериальной популяции для получения стафилококкового, стрептококкового, синегнойного бактериофагов в литературе не описано.

Описанный в литературе способ очистки бактериофагов (авт. св. NN 1412302) включает в себя четыре этапа: микрофильтрацию, которая проводится в тупиковом режиме в три этапа (на фильтр-картоне, на целлюлозных мембранах с размером пор 0,5-0,7 мкм, затем на целлюлозных мембранах с размером пор 0,2 мкм) и четвертый этап очистка фаголизатов методом ультрафильтрации в режиме тангенциального потока через полые волокна с порогом задержания веществ 100 КД. Предлагаемый способ включает двухэтапную очистку: микрофильтрацию в режиме тангенциального потока на капроновых мембранах с размером пор 0,2 мкм и очистку ультрафильтрацией в режиме тангенциального потока на плоских мембранах с размером пор 150-200 КД. Предлагаемый способ микрофильтрации на капроновых мембранах более технологичен, производителен и выдерживает 50-70 циклов в отличие от одноразовых целлюлозных мембран и фильтр-картона. Плоские мембраны для ультрафильтрации имеют размер пор 150-200 КД, они более производительны, чем модули с полыми волокнами, вследствие большей скорости потока на плоскорамных установках, определяемой диаметром просвета волокна (полые волокна) и высотой камеры (плоскорамная установка). Использование полых волокон не позволяет в отличие от плоских мембран удалять из фаголизатов вещества, в том числе и фракции эндотоксина, образующиеся при фаголизисе, с молекулярной массой более 100 КД. Очистка на полых волокнах фаголизатов, полученных на таких средах, как мясопептонный бульон и бульон Мартена, содержащих высокомолекулярные фракции белков и пептидов, практически невозможна вследствие образования слоя белка на внутренней поверхности волокон и замедления фильтрации из-за белок-белковых взаимодействий. На плоскорамных установках фаголизаты, полученные на мясопептонном бульоне и бульоне Мартена, фильтруются также хорошо, как и фаголизаты, не содержащие высокомолекулярных белков и пептидов питательных сред.

Проведенный анализ свидетельствует, что предлагаемая совокупность существенных признаков является новой, а влияние отличительных от прототипа существенных признаков на достижение технического результата не следует из известного уровня техники, т.е. предлагаемый способ соответствует критериям «новизна» и»изобретательский уровень».

П р и м е р 1. Способ получения пиобактериофага.

Способ культивирования бактериофагов, входящих в состав препарата пиобактериофага, является общим для всех. Культивирование бактериофагов проводят на бульоне Мартена, Хоттингера, мясопептонном бульоне или бульоне на основе ферментативного гемогидролизата. Культивирование проводят в ферментерах в условиях интенсивной аэрации и перемешивания при 30-70%-ном насыщении растворенным кислородом с использованием экспоненциально размножающейся бактериальной популяции. Каждый вид бактериофагов культивируют раздельно. Для этого в питательную среду вносят бактериальную культуру до конечной концентрации 510 7 бакт. кл/мл и выращивают при 37 о С в условиях 30-70%-ного насыщения кислородом в течение 1,0-1,5 ч до концентрации 2-510 8 бакт. кл/мл, после чего заражают бактериофагом с множественностью заражения 1/30 и культивируют в том же режиме в течение 1-2 ч до полного лизиса бактериальной популяции, после чего все бактериофаги сводят в единый объем, перемешивают и фильтруют в режиме тангенциального потока через фильтры с размером пор 0,2 мкм. Время фильтрации 100 л препарата составляет 10 мин. Отфильтрованный фаголизат очищают путем фильтрации через плоскорамный аппарат УФР-4М в режиме тангенциального потока через мембраны с порогом задержания веществ 150-200 КД. Степень очистки бактериофагов от метаболитов бактериальных клеток составляет 981,1 Затем очищенный препарат пиобактериофага фильтруют через стерильные фильтры типа «Владипор» с размером пор 0,2 мкм, после чего стерильно разливают в ампулы и флаконы и используют для лечения.

Как видно из табл. 1, использование предлагаемого способа позволяет:
повысить на 50-90% выход биомассы фагов при клуьтивировании и сократить время культивирования в среднем на 21 ч (Р 5 -10 6 по Аппельману, в титре 10 6 -10 7 в отношении бактерий стрептококка. Активность компонентов бактериофагов кишечной и синегнойной палочек, протея также находилась в пределах 10 5 -10 6 по Аппельману (табл. 2). В отличие от прототипа препарат очищенного пиобактериофага обладал антибактериальной активностью в отношении бактерий клебсиелл пневмонии в титре 10 5 -10 7 .

Таким образом, использование предлагаемого способа получения препарата пиобактериофага позволяет расширить на 752% спектр антибактериальной активности в отношении бактерий клебсиелл пневмонии, а также позволяет повысить качество за счет снижения токсических свойств препарата при полостном внутрибрюшинном введении за счет удаления в процессе очистки 981,1% из состава препарата метаболитов бактериальных клеток и белков культуральной среды.

Кроме того, использование предлагаемого способа позволяет повысить выход на 50-90% биомассы бактериофагов при их культивировании, сократить время культивирования в среднем на 21 ч, повысить производительность и сократить время технологического цикла фильтрации в среднем на 25 ч и вести крупномасштабное производство.

Внедрение препарата очищенного пиобактериофага позволит дать практическому здравоохранению эффективный антибактериальный препарат, превосходящий по своей активности как антибиотики широкого спектра действия, так и антибиотики резерва, отличительным признаком которого в отличие от антибиотиков является отсутствие токсичности.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИОБАКТЕРИОФАГА, включающий культивирование бактерий и бактериофагов стафилококка, стрептококка, синегнойной палочки, кишечной палочки и протея в жидкой питательной среде с последующим сведением в один объем и стерилизующей микрофильтрацией, отличающийся тем, что дополнительно проводят культивирование бактерий и бактериофагов клебсиелл, для получения фаголизатов используют бактерии-продуценты в экспоненциальной фазе роста, микрофильтрацию проводят через мембраны с размером пор 0,2 мкм, после чего проводят ультрафильтрацию через мембраны с порогом задержания веществ 150 — 200 КД в режиме тангенциального потока.

Источник